W związku z corocznym zatwierdzaniem wielu nowych leków, zapotrzebowanie na leki biologiczne na rynku farmaceutycznym gwałtownie rośnie. w społeczność bioanalityczna, badanie dużych cząsteczek jest obecnie gorącym tematem dyskusji.

Rosnące znaczenie peptydów i białek jako środków terapeutycznych w połączeniu z kolosalnymi możliwościami, jakie oferuje nowa technologia oparta na stwardnieniu rozsianym, otworzyły przed naukowcami bioanalitycznymi nowy świat.

Testy wiązania ligandów (LBA), takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA) lub identyfikacja poszczególnych peptydów za pomocą UV przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), to standardowe metody ilościowego oznaczania leków biologicznych.

Jednakże metody te są zazwyczaj drogie, czasochłonne w opracowaniu i mają ograniczoną selektywność i reaktywność krzyżową przeciwciał.

Skutkuje to brakiem specyficzności zakłóceń i wysokimi poziomami tła, które nie są odpowiednie do spełnienia specyfikacji przemysł biofarmaceutyczny w celu identyfikacji różnych białek i peptydów z rosnącą czułością i powtarzalnością.

Chromatografia cieczowa połączona z tandemową spektrometrią mas (LC-MS-MS) jest szeroko stosowana w bioanalizie małych cząsteczek w laboratoriach farmaceutycznych od lat 1980. XX wieku.

Podobnie jak mniejsze cząsteczki, LC-MS-MS ma również zalety w przypadku leków biologicznych:

• Nie jest podatny na reaktywność krzyżową przeciwciała, ponieważ LC-MS-MS polega na bezpośredniej ocenie właściwości chemicznych analitu.
• Zapewnia doskonałą selektywność, umożliwiając rozróżnienie i określenie ilościowe niezwykle homologicznych izoform z precyzją i dokładnością w dużym liniowym zakresie dynamiki, nawet na niskich poziomach.
• Ze względu na wysoką czułość analityczną i selektywność, a także wysoką wydajność, LC-MS/MS uznano za podstawową technikę pomiaru stężeń leków przeciwpsychotycznych pierwszej i drugiej generacji u pacjentów ze schizofrenią.

Spektroskopia mas zyskała większe zainteresowanie analizą peptydów i białek w porównaniu z LBA, ponieważ:

• LBA wykrywa cząsteczki na podstawie powinowactwa wiązania i struktury konformacyjnej 3D, ale może nie być w stanie rozróżnić białka od jego metabolitów.
• W przeciwieństwie do LBA, podejścia oparte na MS mają potencjał i byłyby w stanie dostarczyć bardziej precyzyjnych danych na temat niezmienionych poziomów peptydów/białek w sytuacjach, gdy metabolizm utrudnia wiarygodne dane LBA.
• Techniki stwardnienia rozsianego zazwyczaj oferują bezwzględne stężenia leków. Może to zależeć od formy testu dla metod LBA i mogą one zapewniać stężenie bezwzględne lub wolne leku.

Jednak oparty na LC-MS-MS bioanaliza leków wielkocząsteczkowych stwarza szereg nowych przeszkód, takich jak trudności w przetwarzaniu próbek i ekstrakcji w celu ilościowego oznaczania dużych cząsteczek.

Powody są następujące:

• Peptydy i białka tła w matrycach biologicznych konkurują z cząsteczką bioterapeutyczną będącą przedmiotem zainteresowania, powodując problemy z zakłóceniami i wpływając na dokładność.
• Brak znaczących dowodów podczas oznaczania ilościowego wynika z niemożności wyłapania wolnych leków, które mogą krążyć w surowicy.

Ostatnio wprowadzono wiele udoskonaleń technologicznych LC-MS-MS, które mogą pomóc w rozwiązaniu wszystkich tych problemów.

W szczególności wzrost wydajności jonizacji i transmisji jonów w najnowszych instrumentach z potrójnym kwadrupolem znacznie zwiększył czułość, umożliwiając wykrywanie substancji biologicznych na poziomie pikogramów lub subfemtogramów.

Postępy technologiczne zastosowane w LC-MS-MS obejmują ulepszone ogniskowanie kolizyjne jonów, które dostarcza więcej jonów do detektora, a także ulepszenia zakresu dynamicznego detektora w celu zwiększenia czułości i wydajności bioanalizy.

Ostatnio rośnie zainteresowanie integracją wzbogacania powinowactwa immunologicznego LBA z kwantyfikacją LC-MS-MS w celu zintegrowania LBA z czułością i selektywnością technologii LC-MS-MS z większą precyzją i szerszymi możliwościami wychwytu immunologicznego.

Zautomatyzowane przełączanie kolumn LC–MS/MS, sorbent z wypełnieniem do mikroekstrakcji (MEPS)/LC-MS/MS i ekstrakcja za pomocą jednorazowej pipety (DPX)/LC-MS/MS to tylko niektóre z najnowszych technik stosowanych do ilościowego oznaczania dużych cząsteczek .

W przypadku stosowania technologii opartych na LC-MS/MS do bioanalizy dużych cząsteczek powszechnie stosuje się dwie główne metody:

1. Metoda LC–MS(/MS) z nienaruszonym analitem

Podejście to stosuje się głównie w przypadku peptydów, małych białek i oligonukleotydów o masie cząsteczkowej zazwyczaj poniżej 4–8 kDa.

2. Podejście LC–MS/MS z wykorzystaniem etapu trawienia

To podejście jest bardziej złożone i stosowane głównie w przypadku białek lub większych peptydów. Podejście to obejmuje etap trawienia (enzymatycznego) jako uzupełnienie podejścia z nienaruszonym analitem, w którym białko/peptyd jest trawione na mniejsze peptydy.

Obecnie najczęściej stosuje się tradycyjne instrumenty z potrójnym kwadrupolem LC-MS/MS do oznaczania ilościowego zarówno w przypadku podejścia do analitu nienaruszonego, jak i strawionego.

Zgodnie z obowiązującymi normami, jako kryterium zatwierdzenia wielkocząsteczkowych testów LC-MS/MS stosuje się wartość 4-6-15 (cztery z sześciu próbek kontroli jakości powinny mieścić się w granicach 15% wartości nominalnej). Zaproponowano wymagania dotyczące zatwierdzenia 4-6-20 dla większych, nienaruszonych analitów, w szczególności w przypadku stosowania hybrydowego podejścia LC-MS/MS.

Znakowany peptyd do analizy peptydów lub albo znakowane nienaruszone białko, albo znakowany peptyd sygnaturowy można zastosować jako standard wewnętrzny (IS), aby ustalić skuteczną metodę LC-MS/MS.

ICH i FDA wydały kilka dokumentów zawierających wytyczne, które mają pomóc w standaryzacji badań bioanalizy dużych cząsteczek. Zalecenia te można znaleźć na stronie internetowej odpowiedniej agencji regulacyjnej.

Chociaż technologie LC-MS-MS stały się bardziej odpowiednie do bioanalizy biologicznej, dla osób niebędących ekspertami, którzy muszą tworzyć i mierzyć nowe leki biologiczne, różnorodność technologii i technik spektrometrii mas, metod przygotowania próbek i odczynników może być przytłaczająca.

Nowe postępy w oprzyrządowaniu i oprogramowaniu spowodują istotne zmiany w spójności i wydajności testów bioanalitycznych, zapewniając dokładniejsze i zgodne wyniki, co będzie miało istotne konsekwencje dla bezpieczeństwa pacjentów.

LITERATURA

1. Suma Ramagiri, Trendy w bioanalizie przy użyciu LC–MS–MS. Kolumna, Kolumna-12-07-2015, tom 11, wydanie 22.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt i Philip Timmerman, LC–MS/MS dużych cząsteczek w regulowanym środowisku bioanalitycznym – jakie kryteria akceptacji zastosować? Nauka przyszłości, BIOANALIZA TOM. 5, NIE. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193