Da jährlich viele neue Therapeutika zugelassen werden, ist die Nachfrage nach Biologika auf dem Pharmamarkt exponentiell gewachsen. Im bioanalytische Gemeinschaftist die Untersuchung großer Moleküle mittlerweile ein heißes Diskussionsthema.

Die zunehmende Bedeutung von Peptiden und Proteinen als therapeutische Wirkstoffe hat in Kombination mit den enormen Möglichkeiten, die die neue MS-basierte Technologie bietet, den bioanalytischen Wissenschaftlern eine neue Welt eröffnet.

Ligandenbindungsassays (LBAs) wie Enzymimmunoassays (ELISA) oder die UV-Identifizierung einzelner Peptide mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) sind die Standardmethoden zur Quantifizierung biologischer Arzneimittel.

Diese Methoden sind jedoch typischerweise teuer, zeitaufwändig in der Entwicklung und weisen eine begrenzte Selektivität und Antikörper-Kreuzreaktivität auf.

Dies führt zu einem Mangel an Interferenzspezifität und hohen Hintergrundpegeln, die nicht zur Erfüllung der Spezifikationen geeignet sind biopharmazeutische Industrie um verschiedene Proteine ​​und Peptide mit zunehmender Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu identifizieren.

Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS-MS) wird seit den 1980er Jahren häufig für die Bioanalyse kleiner Moleküle in pharmazeutischen Labors eingesetzt.

Wie kleinere Moleküle bietet auch LC-MS-MS Vorteile für Biologika:

• Es besteht keine Gefahr einer Kreuzreaktivität des Antikörpers, da LC-MS-MS eine direkte Beurteilung der chemischen Eigenschaften des Analyten beinhaltet.
• Es bietet eine hervorragende Selektivität und ist in der Lage, extrem homologe Isoformen mit Präzision und Genauigkeit über einen großen linearen Dynamikbereich zu erkennen und zu quantifizieren, selbst bei niedrigen Konzentrationen.
• Aufgrund seiner hohen analytischen Sensitivität und Selektivität sowie seiner Hochdurchsatzfähigkeit gilt LC-MS/MS als die primäre Technik zur Messung der Konzentrationen von Antipsychotika der ersten und zweiten Generation bei Schizophreniepatienten.

Die Massenspektroskopie hat im Vergleich zur LBA für die Peptid- und Proteinanalyse zunehmend an Interesse gewonnen, weil:

• LBA erkennt Moleküle anhand der Bindungsaffinität und der 3D-Konformationsstruktur, ist jedoch möglicherweise nicht in der Lage, zwischen einem Protein und seinen Metaboliten zu unterscheiden.
• Im Gegensatz zu LBA haben MS-basierte Ansätze das Potenzial und wären in der Lage, präzisere Daten zu unveränderten Peptid-/Proteinspiegeln in Situationen zu liefern, in denen der Stoffwechsel zuverlässige LBA-Daten behindert.
• MS-Techniken bieten normalerweise absolute Konzentrationen von Medikamenten. Dies kann von der Art des Tests bei LBA-Methoden abhängen und sie können entweder die absolute oder die freie Konzentration von Arzneimitteln liefern.

Allerdings LC-MS-MS-basiert Bioanalyse für großmolekulare Arzneimittel bringt eine Reihe neuer Hürden mit sich, etwa Schwierigkeiten bei der Probenaufbereitung und Extraktionsmaßnahmen zur Quantifizierung großer Moleküle.

Zu den Gründen gehören:

• Die Hintergrundpeptide und -proteine ​​in den biologischen Matrizen konkurrieren mit dem biotherapeutischen Molekül von Interesse, was zu Interferenzproblemen führt und die Genauigkeit beeinträchtigt.
• Der Mangel an aussagekräftigen Beweisen während der Quantifizierung ist darauf zurückzuführen, dass es nicht möglich ist, freie Arzneimittel zu erfassen, die im Serum zirkulieren könnten.

In jüngster Zeit wurden zahlreiche technologische Fortschritte im LC-MS-MS-Bereich erzielt, die zur Lösung all dieser Probleme beitragen können.

Insbesondere die Steigerung der Ionisierungseffizienz und der Ionenübertragung in neueren Dreifach-Quadrupol-Instrumenten hat die Empfindlichkeit erheblich verbessert, sodass Biologika im Pikogramm- oder Sub-Femtogramm-Bereich nachgewiesen werden können.

Zu den technologischen Fortschritten im LC-MS-MS gehören eine verbesserte Ionenkollisionsfokussierung, die mehr Ionen zum Detektor bringt, sowie Verbesserungen des Dynamikbereichs des Detektors, um die Empfindlichkeit und Effizienz der Bioanalyse zu erhöhen.

In letzter Zeit besteht ein wachsendes Interesse an der Integration der LBA-Immunaffinitätsanreicherung mit der LC-MS-MS-Quantifizierung, um LBAs mit der Empfindlichkeit und Selektivität von LC-MS-MS-Technologien mit größerer Präzision und breiteren Möglichkeiten zur Immunabfangung zu integrieren.

Automatisierte Säulenwechsel-LC-MS/MS, Mikroextraktion mit gepacktem Sorbens (MEPS)/LC-MS/MS und Einwegpipettenextraktion (DPX)/LC-MS/MS sind einige der neueren Techniken, die zur Quantifizierung großer Moleküle eingesetzt werden .

Bei der Verwendung von LC-MS/MS-basierten Technologien für die Bioanalyse großer Moleküle werden häufig zwei Hauptmethoden verwendet:

1. LC-MS(/MS)-Ansatz mit intaktem Analyten

Dieser Ansatz wird vorwiegend für Peptide, kleine Proteine ​​und Oligonukleotide mit einem Molekulargewicht typischerweise unter 4–8 kDa verwendet.

2. LC-MS/MS-Ansatz mit einem Verdauungsschritt

Dieser Ansatz ist komplexer und wird hauptsächlich für Proteine ​​oder größere Peptide verwendet. Dieser Ansatz beinhaltet zusätzlich zum Ansatz des intakten Analyten einen (enzymatischen) Verdauungsschritt, bei dem das Protein/Peptid in kleinere Peptide verdaut wird.

Heutzutage werden für die Quantifizierung sowohl des intakten als auch des verdauten Analytansatzes am häufigsten herkömmliche LC-MS/MS-Triple-Quadrupol-Instrumente verwendet.

Gemäß den bestehenden Standards wird 4-6-15 (vier von sechs QC-Proben sollten innerhalb von 15 % des Nominalwerts liegen) als Zulassungskriterium für großmolekulare LC-MS/MS-Assays verwendet. Für größere intakte Analyten werden Zulassungsanforderungen gemäß 4-6-20 vorgeschlagen, insbesondere wenn ein hybrider LC-MS/MS-Ansatz verwendet wird.

Ein markiertes Peptid für die Peptidanalyse oder entweder ein markiertes intaktes Protein oder ein markiertes Signaturpeptid kann als interner Standard (IS) zur Etablierung einer erfolgreichen LC-MS/MS-Methode verwendet werden.

Mehrere Richtliniendokumente wurden von der ICH und der FDA herausgegeben, um die Standardisierung von Studien zur Bioanalyse großer Moleküle zu unterstützen. Diese Empfehlungen finden Sie auf der Website der zuständigen Aufsichtsbehörde.

Während sich LC-MS-MS-Technologien immer besser für die biologische Bioanalyse eignen, könnte die Vielfalt der Massenspektrometrietechnologien und -techniken, Probenvorbereitungsmethoden und Reagenzien für Laien, die neue Biologika herstellen und messen müssen, überwältigend sein.

Die neuen Fortschritte bei Instrumentierung und Software werden erhebliche Änderungen in der Konsistenz und Effizienz von Bioanalysetests mit sich bringen und genauere und konformere Ergebnisse mit erheblichen Auswirkungen auf die Patientensicherheit liefern.

REFERENZEN

1. Suma Ramagiri, Trends in der Bioanalyse mittels LC–MS–MS. Die Kolumne, The Column-12, Band 07, Ausgabe 2015.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt und Philip Timmerman, LC–MS/MS großer Moleküle in einer regulierten bioanalytischen Umgebung – welche Akzeptanzkriterien sind anzuwenden? Zukunftswissenschaft, BIOANALYSE VOL. 5, NEIN. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193