测定生物样品中大分子药物的 LC-MSMS 方法的最新进展

2021 年 2 月 23 日

发表于 - Veeda

随着每年有许多新疗法获得批准，制药市场对生物制剂的需求呈指数增长。在里面生物分析界，大分子的研究现在是讨论的热点话题。

肽和蛋白质作为治疗剂的重要性与日俱增，加上新的基于质谱的技术提供的巨大机遇，为生物分析科学家打开了一个新世界。

配体结合测定 (LBA)，例如酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或使用高效液相色谱 (HPLC) 对单个肽进行 UV 鉴定，是生物药物定量的标准方法。

然而，这些方法通常昂贵、开发耗时，并且选择性和抗体交叉反应性有限。

这导致缺乏干扰特异性和高背景水平，不适合满足技术规范生物制药行业以提高灵敏度和重现性来识别不同的蛋白质和肽。

自 1980 世纪 XNUMX 年代以来，液相色谱结合串联质谱 (LC-MS-MS) 已广泛用于制药实验室的小分子生物分析。

与较小的分子一样，LC-MS-MS 对于生物制剂也具有优势：

与 LBA 相比，质谱法对肽和蛋白质分析越来越感兴趣，因为：

然而，基于 LC-MS-MS 的大分子药物的生物分析带来了一系列新的障碍，例如用于大分子定量的样品处理和提取措施的困难。

原因包括以下几点：

最近，许多 LC-MS-MS 技术的进步可以帮助解决所有这些问题。

特别是，最近三重四极杆仪器中电离效率和离子传输的提高大大提高了灵敏度，允许在皮克或亚飞克级别检测生物制剂。

LC-MS-MS 内部技术的进步包括改进的离子碰撞聚焦，可为检测器带来更多离子，以及升级检测器的动态范围以提高生物分析灵敏度和效率。

最近，人们越来越关注将 LBA 免疫亲和富集与 LC-MS-MS 定量相结合，以将 LBA 与 LC-MS-MS 技术的灵敏度和选择性相结合，从而具有更高的精度和更广泛的免疫捕获能力。

自动柱切换 LC-MS/MS、微萃取填充吸附剂 (MEPS)/LC-MS/MS 和一次性移液器萃取 (DPX)/LC-MS/MS 是最近用于定量大分子的一些技术。

使用基于 LC-MS/MS 的技术进行大分子生物分析时，广泛使用两种主要方法：

1. 完整分析物 LC-MS(/MS) 方法

这种方法主要用于分子量通常低于 4-8 kDa 的肽、小蛋白质和寡核苷酸。

2. 使用消化步骤的 LC-MS/MS 方法

这种方法比较复杂，主要用于蛋白质或较大的肽。除了完整分析物方法之外，该方法还涉及（酶促）消化步骤，其中蛋白质/肽被消化成更小的肽。

如今，最常见的是使用传统的 LC-MS/MS 三重四极杆仪器对完整和消化的分析物方法进行定量。

根据现有标准，4-6-15（六个QC样品中的四个应在标称值的15%以内）被用作大分子LC-MS/MS检测的批准标准。 4-6-20 针对较大的完整分析物提出了批准要求，特别是在使用混合 LC-MS/MS 方法的情况下。

用于肽分析的标记肽或标记的完整蛋白质或标记的特征肽可用作内标 (IS)，以建立成功的 LC-MS/MS 方法。

ICH 和 FDA 已发布了几份指导文件，以帮助标准化大分子生物分析研究。这些建议可以在相应监管机构的网站上找到。

虽然 LC-MS-MS 技术已经发展到更适合生物生物分析，但对于需要创建和测量新生物制剂的非专家来说，质谱技术和技术、样品制备方法和试剂的多样性可能令人眼花缭乱。

仪器和软件的新进步将为生物分析测试的一致性和效率带来重大变化，提供更准确和合规的结果，并对患者安全产生重大影响。

参考文献：

Suma Ramagiri，使用 LC-MS-MS 进行生物分析的趋势。专栏，12 年 07 月 2015 日，第 11 卷，第 22 期。
Magnus Knutsson、Ronald Schmidt 和 Philip Timmerman，在受监管的生物分析环境中对大分子进行 LC-MS/MS – 应用哪种验收标准？未来科学，生物分析卷。 5、没有。 18、 https://doi.org/10.4155/bio.13.193

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