Avec de nombreux nouveaux produits thérapeutiques approuvés chaque année, la demande de produits biologiques a connu une croissance exponentielle sur le marché pharmaceutique. Dans le communauté bioanalytique, l’étude des grosses molécules est désormais un sujet de discussion brûlant.

L’importance croissante des peptides et des protéines en tant qu’agents thérapeutiques, combinée aux opportunités colossales offertes par la nouvelle technologie basée sur la SP, a ouvert un nouveau monde pour les scientifiques bioanalytiques.

Les tests de liaison au ligand (LBA) tels que les tests immuno-enzymatiques (ELISA) ou l'identification UV de peptides individuels par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sont les méthodes standard pour la quantification des médicaments biologiques.

Cependant, ces méthodes sont généralement coûteuses, longues à développer et ont une sélectivité et une réactivité croisée des anticorps limitées.

Il en résulte un manque de spécificité de brouillage et des niveaux de bruit de fond élevés qui ne sont pas appropriés pour répondre aux spécifications du industrie biopharmaceutique pour identifier différentes protéines et peptides avec une sensibilité et une reproductibilité croissantes.

La chromatographie liquide combinée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS-MS) est largement utilisée pour la bioanalyse de petites molécules dans les laboratoires pharmaceutiques depuis les années 1980.

Tout comme les molécules plus petites, la LC-MS-MS présente également des avantages pour les produits biologiques :

• Il n'est pas sensible à la réactivité croisée de l'anticorps car la LC-MS-MS implique une évaluation directe des propriétés chimiques de l'analyte.
• Il offre une excellente sélectivité, étant capable de discerner et de quantifier des isoformes extrêmement homologues avec précision et exactitude sur une large plage dynamique linéaire, même à de faibles niveaux.
• En raison de sa sensibilité analytique et de sa sélectivité élevées, en plus de sa capacité à haut débit, la LC-MS/MS a été considérée comme la principale technique pour mesurer les concentrations d'antipsychotiques de première et de deuxième génération chez les patients schizophrènes.

La spectroscopie de masse a suscité un intérêt accru pour l'analyse des peptides et des protéines par rapport à la LBA pour les raisons suivantes :

• LBA détecte les molécules sur la base de leur affinité de liaison et de leur structure conformationnelle 3D, mais ils peuvent ne pas être en mesure de faire la distinction entre une protéine et ses métabolites.
• Contrairement à la LBA, les approches basées sur la MS ont le potentiel et seraient capables de produire des données plus précises sur les niveaux inchangés de peptides/protéines dans les situations où le métabolisme entrave la fiabilité des données LBA.
• Les techniques de SEP offrent généralement des concentrations absolues de médicaments. Cela peut dépendre de la forme du test pour les méthodes LBA, et elles peuvent fournir une concentration absolue ou libre du médicament.

Cependant, basé sur LC-MS-MS bioanalyse pour médicaments à grosses molécules pose une série de nouveaux obstacles, comme des difficultés dans le traitement des échantillons et les mesures d’extraction pour la quantification des grosses molécules.

Les raisons sont les suivantes :

• Les peptides et protéines de fond dans les matrices biologiques entrent en compétition avec la molécule biothérapeutique d’intérêt, créant des problèmes d’interférence et ayant un impact sur la précision.
• Le manque de preuves significatives lors de la quantification est dû à l’incapacité de détecter les médicaments libres susceptibles de circuler dans le sérum.

Récemment, de nombreuses avancées technologiques LC-MS-MS ont été réalisées et peuvent aider à résoudre tous ces problèmes.

En particulier, l'augmentation de l'efficacité de l'ionisation et de la transmission des ions dans les récents instruments à triple quadripôle a considérablement amélioré la sensibilité, permettant de détecter les produits biologiques à des niveaux de picogramme ou de sous-femtogramme.

Les avancées technologiques au sein du LC-MS-MS comprennent une focalisation améliorée par collision ionique, qui amène plus d'ions au détecteur, ainsi que des améliorations de la plage dynamique du détecteur pour augmenter la sensibilité et l'efficacité de la bioanalyse.

Récemment, l’intégration de l’enrichissement par immunoaffinité LBA avec la quantification LC-MS-MS a suscité un intérêt croissant afin d’intégrer les LBA à la sensibilité et à la sélectivité des technologies LC-MS-MS avec une plus grande précision et des capacités de capture immunitaire plus larges.

LC-MS/MS à commutation de colonne automatisée, sorbant emballé par microextraction (MEPS)/LC-MS/MS et extraction par pipette jetable (DPX)/LC-MS/MS sont quelques-unes des techniques récentes qui ont été utilisées pour quantifier les grosses molécules. .

Deux méthodes principales sont largement utilisées lors de l’utilisation de technologies basées sur LC-MS/MS pour la bioanalyse de grosses molécules :

1. Approche LC-MS(/MS) pour analytes intacts

Cette approche est principalement utilisée pour les peptides, les petites protéines et les oligonucléotides dont le poids moléculaire est généralement inférieur à 4 à 8 kDa.

2. Approche LC–MS/MS utilisant une étape de digestion

Cette approche est plus complexe et principalement utilisée pour les protéines ou les peptides plus gros. Cette approche implique une étape de digestion (enzymatique) en plus de l’approche de l’analyte intact, où la protéine/le peptide est digéré en peptides plus petits.

Aujourd’hui, il est plus courant d’utiliser des instruments traditionnels à triple quadripôle LC-MS/MS pour la quantification pour les approches d’analyte intact et digéré.

Selon les normes existantes, 4-6-15 (quatre échantillons de contrôle qualité sur six doivent être inférieurs à 15 % de la valeur nominale) est utilisé comme critère d'approbation pour les analyses LC-MS/MS moléculaires à grande échelle. Des exigences d’approbation 4-6-20 sont proposées pour les analytes intacts de plus grande taille, en particulier si une approche hybride LC-MS/MS est utilisée.

Un peptide marqué pour l'analyse peptidique ou une protéine intacte marquée ou un peptide signature marqué peut être utilisé comme étalon interne (IS) pour établir une méthode LC-MS/MS réussie.

Plusieurs documents d'orientation ont été publiés par l'ICH et la FDA pour aider à normaliser les études de bioanalyse de grandes molécules. Ces recommandations peuvent être consultées sur le site Web de l’agence de réglementation compétente.

Alors que les technologies LC-MS-MS ont progressé pour devenir plus appropriées à la bioanalyse biologique, pour les non-experts qui ont besoin de créer et de mesurer de nouveaux produits biologiques, la variété des technologies et techniques de spectrométrie de masse, des méthodes de préparation des échantillons et des réactifs pourrait être écrasante.

Les nouvelles avancées en matière d'instrumentation et de logiciels apporteront des changements substantiels dans la cohérence et l'efficacité des tests de bioanalyse, fournissant des résultats plus précis et plus conformes avec des conséquences significatives sur la sécurité des patients.

Références

1. Suma Ramagiri, Tendances de la bioanalyse utilisant LC – MS – MS. La Chronique, La Chronique-12-07-2015, Volume 11, Numéro 22.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt & Philip Timmerman, LC–MS/MS de grosses molécules dans un environnement bioanalytique réglementé – quels critères d'acceptation appliquer ? Science du futur, BIOANALYSE VOL. 5, NON. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193