Med många nya läkemedel som godkänts årligen har efterfrågan på biologiska läkemedel sett en exponentiell tillväxt på läkemedelsmarknaden. I den bioanalytisk gemenskap, är studiet av stora molekyler nu ett hett diskussionsämne.

Den stora betydelsen av peptider och proteiner som terapeutiska medel, i kombination med de kolossala möjligheter som ny MS-baserad teknologi erbjuder, har låst upp en ny värld för bioanalytiska forskare.

Ligandbindande analyser (LBA) såsom enzymkopplade immunosorbentanalyser (ELISA) eller UV-identifiering av enskilda peptider med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är standardmetoderna för kvantifiering av biologiska läkemedel.

Dessa metoder är dock vanligtvis dyra, tidskrävande att utveckla och har begränsad selektivitet och antikroppskorsreaktivitet.

Detta resulterar i en brist på interferensspecificitet och höga bakgrundsnivåer som inte är lämpliga för att uppfylla specifikationerna för biofarmaceutisk industri att identifiera olika proteiner och peptider med ökande känslighet och reproducerbarhet.

Vätskekromatografi kombinerat med tandemmasspektrometri (LC-MS-MS) har använts i stor utsträckning för bioanalys av små molekyler i farmaceutiska laboratorier sedan 1980-talet.

Liksom mindre molekyler har LC-MS-MS också fördelar för biologiska läkemedel:

• Det är inte mottagligt för antikroppens korsreaktivitet eftersom LC-MS-MS involverar direkt bedömning av analytens kemiska egenskaper.
• Den ger utmärkt selektivitet och kan urskilja och kvantifiera extremt homologa isoformer med precision och noggrannhet över ett stort linjärt dynamiskt område, även vid låga nivåer.
• På grund av sin höga analytiska känslighet och selektivitet har LC-MS/MS, förutom sin höga genomströmningsförmåga, ansetts vara den primära tekniken för att mäta koncentrationerna av första generationens och andra generationens antipsykotika hos schizofrenipatienter.

Masspektroskopi har fått ett ökat intresse för peptid- och proteinanalys jämfört med LBA eftersom:

• LBA detekterar molekyler baserat på bindningsaffinitet och 3D-konformationsstruktur, men de kanske inte kan skilja mellan ett protein och dess metaboliter.
• Till skillnad från LBA har MS-baserade tillvägagångssätt potentialen och skulle kunna producera mer exakta data om oförändrade peptid/proteinnivåer i situationer där metabolism hämmar tillförlitliga LBA-data.
• MS-tekniker erbjuder vanligtvis absoluta koncentrationer av mediciner. Detta kan bero på formen av en analys för LBA-metoder, och de kan ge antingen absolut eller fri koncentration av läkemedel.

Dock LC-MS-MS-baserad bioanalys för läkemedel med stora molekyler utgör en rad nya hinder, som svårigheter vid provbearbetning och extraktionsåtgärder för kvantifiering av stora molekyler.

Skälen inkluderar följande:

• Bakgrundspeptiderna och proteinerna i de biologiska matriserna konkurrerar med den bioterapeutiska molekylen av intresse, vilket skapar störningsproblem och påverkar noggrannheten.
• Bristen på betydande bevis under kvantifieringen uppstår för att inte kunna fånga fria läkemedel som kan cirkulera i serum.

Nyligen har många LC-MS-MS tekniska framsteg gjorts som kan hjälpa till att lösa alla dessa problem.

I synnerhet har ökningen av joniseringseffektiviteten och jonöverföringen i de senaste trippelkvadrupolinstrumenten avsevärt förbättrat känsligheten, vilket gör att biologiska läkemedel kan detekteras vid pikogram- eller sub-femtogramnivåer.

Framsteg inom teknologier inuti LC-MS-MS inkluderar förbättrad jonkollisionsfokusering, vilket ger fler joner till detektorn, samt uppgraderingar av detektorns dynamiska omfång för att öka bioanalysens känslighet och effektivitet.

På senare tid har det funnits ett växande intresse för att integrera LBA-immunaffinitetsanrikning med LC-MS-MS-kvantifiering för att integrera LBA med känsligheten och selektiviteten hos LC-MS-MS-teknologier med större precision och bredare immunfångningsförmåga.

Automatiserad kolumnväxlande LC–MS/MS, Microextraction packed sorbent (MEPS)/LC-MS/MS och Disposable Pipette Extraction (DPX)/LC-MS/MS är några av de senaste teknikerna som har använts för att kvantifiera stora molekyler .

Två huvudmetoder används ofta vid användning av LC-MS/MS-baserade teknologier för bioanalys av stora molekyler:

1. Intakt analyt LC–MS(/MS) tillvägagångssätt

Detta tillvägagångssätt används främst för peptider, små proteiner och oligonukleotider med en molekylvikt vanligtvis under 4–8 kDa.

2. LC–MS/MS tillvägagångssätt med hjälp av ett nedbrytningssteg

Detta tillvägagångssätt är mer komplext och används främst för proteiner eller större peptider. Detta tillvägagångssätt involverar ett (enzymatiskt) nedbrytningssteg förutom den intakta analytmetoden, där proteinet/peptiden spjälkas till mindre peptider.

Idag är det vanligast att använda traditionella LC-MS/MS trippelkvadrupolinstrument för kvantifiering för både den intakta och den digererade analytmetoden.

Enligt befintliga standarder används 4-6-15 (fyra av sex QC-prover bör ligga inom 15 % av det nominella värdet) som ett godkännandekriterium för stora molekylära LC-MS/MS-analyser. 4-6-20 godkännandekrav föreslås för större intakta analyter, i synnerhet om en hybrid LC-MS/MS-metod används.

En märkt peptid för peptidanalys eller antingen ett märkt intakt protein eller en märkt signaturpeptid kan användas som en intern standard (IS) för att etablera en framgångsrik LC-MS/MS-metod.

Flera riktlinjer har utfärdats av ICH och FDA för att hjälpa till att standardisera bioanalysstudier av stora molekyler. Dessa rekommendationer finns på webbplatsen för lämplig tillsynsmyndighet.

Medan LC-MS-MS-teknologier har utvecklats för att vara mer lämpliga för biologisk bioanalys, för icke-experter som behöver skapa och mäta nya biologiska ämnen, kan variationen av masspektrometritekniker och tekniker, provberedningsmetoder och reagens vara överväldigande.

De nya framstegen inom instrumentering och mjukvara kommer att medföra betydande förändringar i konsekvensen och effektiviteten av bioanalystester, vilket ger mer exakta och överensstämmande resultat med betydande patientsäkerhetskonsekvenser.

REFERENSER

1. Suma Ramagiri, Trender inom bioanalys med LC–MS–MS. The Column, The Column-12-07-2015, Volume 11, Issue 22.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt & Philip Timmerman, LC–MS/MS för stora molekyler i en reglerad bioanalytisk miljö – vilka acceptanskriterier ska tillämpas? Future Science, BIOANALYSIS VOL. 5, NEJ. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193