매년 많은 새로운 치료법이 승인되면서 제약 시장에서는 생물학적 제제에 대한 수요가 기하급수적으로 증가했습니다. 에서 생물분석 커뮤니티, 거대 분자에 대한 연구가 이제 뜨거운 논의 주제입니다.

새로운 MS 기반 기술이 제공하는 엄청난 기회와 결합하여 치료제로서 펩타이드와 단백질의 눈덩이처럼 불어나는 중요성은 생물분석 과학자들에게 새로운 세계를 열어주었습니다.

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)과 같은 리간드 결합 분석(LBA) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용한 개별 펩타이드의 UV 식별은 생물학적 약물 정량을 위한 표준 방법입니다.

그러나 이러한 방법은 일반적으로 개발에 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 선택성과 항체 교차 반응성이 제한되어 있습니다.

이로 인해 간섭 특이성이 부족하고 배경 수준이 높아서 사양을 충족하는 데 적합하지 않습니다. 바이오제약 산업 감도와 재현성을 높여 다양한 단백질과 펩타이드를 식별합니다.

직렬 질량 분석법(LC-MS-MS)과 결합된 액체 크로마토그래피는 1980년대부터 제약 실험실에서 소분자 생체 분석에 널리 사용되었습니다.

더 작은 분자와 마찬가지로 LC-MS-MS도 생물학적 제제에 이점을 제공합니다.

• LC-MS-MS에는 분석물질의 화학적 특성을 직접 평가하기 때문에 항체의 교차 반응이 발생하지 않습니다.
• 이는 탁월한 선택성을 제공하여 낮은 수준에서도 큰 선형 동적 범위에 걸쳐 극도로 상동성인 이소형을 정밀도와 정확도로 식별하고 정량화할 수 있습니다.
• LC-MS/MS는 높은 처리량 성능 외에도 높은 분석 감도와 선택성으로 인해 정신분열증 환자의 XNUMX세대 및 XNUMX세대 항정신병 약물 농도를 측정하는 주요 기술로 간주되어 왔습니다.

질량 분석기는 다음과 같은 이유로 LBA에 비해 펩타이드 및 단백질 분석에 대한 관심이 높아졌습니다.

• LBA는 결합 친화도와 3D 형태 구조를 기반으로 분자를 감지하지만 단백질과 그 대사산물을 구별하지 못할 수도 있습니다.
• LBA와 대조적으로, MS 기반 접근법은 잠재력을 갖고 있으며 신진대사가 신뢰할 수 있는 LBA 데이터를 방해하는 상황에서 변하지 않은 펩타이드/단백질 수준에 대한 보다 정확한 데이터를 생성할 수 있습니다.
• MS 기술은 일반적으로 약물의 절대 농도를 제공합니다. 이는 LBA 방법에 대한 분석 형식에 따라 달라질 수 있으며 약물의 절대 농도 또는 자유 농도를 제공할 수 있습니다.

그러나 LC-MS-MS 기반 고분자 약물의 생체분석 이는 샘플 처리의 어려움과 큰 분자의 정량화를 위한 추출 조치와 같은 다양한 새로운 장애물을 제기합니다.

그 이유는 다음과 같습니다.

• 생물학적 매트릭스의 배경 펩타이드와 단백질은 관심 있는 바이오치료제 분자와 경쟁하여 간섭 문제를 일으키고 정확도에 영향을 미칩니다.
• 정량화 과정에서 유의미한 증거가 부족한 이유는 혈청에 순환할 수 있는 자유 약물을 포착할 수 없기 때문입니다.

최근에는 이러한 모든 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있는 많은 LC-MS-MS 기술 발전이 이루어졌습니다.

특히, 최근 삼중 사중극자 장비의 이온화 효율과 이온 전달의 증가로 감도가 크게 향상되어 피코그램 또는 서브펨토그램 수준에서 생물학적 제제를 검출할 수 있게 되었습니다.

LC-MS-MS 내부 기술의 발전에는 검출기에 더 많은 이온을 제공하는 향상된 이온 충돌 포커싱뿐만 아니라 생체 분석 감도와 효율성을 높이기 위한 검출기의 동적 범위 업그레이드도 포함됩니다.

최근 LBA 면역친화성 강화와 LC-MS-MS 정량화를 통합하여 LBA를 LC-MS-MS 기술의 민감도 및 선택성과 통합하여 더 높은 정밀도와 더 넓은 면역 포획 기능을 제공하는 데 대한 관심이 높아지고 있습니다.

자동 컬럼 전환 LC-MS/MS, MEPS(미세추출 충진 흡착제)/LC-MS/MS 및 DPX(일회용 피펫 추출)/LC-MS/MS는 거대 분자를 정량화하는 데 사용되는 최근 기술 중 일부입니다. .

큰 분자의 생체 분석을 위해 LC-MS/MS 기반 기술을 사용할 때 두 가지 주요 방법이 널리 사용됩니다.

1. Intact 분석물질 LC-MS(/MS) 접근 방식

이 접근법은 일반적으로 4~8kDa 미만의 분자량을 갖는 펩타이드, 작은 단백질 및 올리고뉴클레오티드에 주로 사용됩니다.

2. 분해 단계를 사용한 LC-MS/MS 접근 방식

이 접근법은 더 복잡하며 주로 단백질이나 더 큰 펩타이드에 사용됩니다. 이 접근 방식에는 단백질/펩타이드가 더 작은 펩타이드로 소화되는 손상되지 않은 분석물 접근 방식 외에 (효소적) 소화 단계가 포함됩니다.

오늘날에는 원형 분석물질과 분해된 분석물질 접근 방식 모두에 대한 정량화를 위해 기존 LC-MS/MS 삼중 사중극자 기기를 사용하는 것이 가장 일반적입니다.

기존 표준에 따르면 4-6-15(QC 샘플 15개 중 4개는 공칭 값의 6% 이내여야 함)가 대규모 분자 LC-MS/MS 분석에 대한 승인 기준으로 사용됩니다. 특히 하이브리드 LC-MS/MS 접근 방식을 사용하는 경우 더 큰 손상되지 않은 분석물에 대해 20-XNUMX-XNUMX 승인 요구 사항이 제안됩니다.

펩타이드 분석을 위한 표지된 펩타이드 또는 표지된 손상되지 않은 단백질 또는 표지된 시그니처 펩타이드를 내부 표준(IS)으로 사용하여 성공적인 LC-MS/MS 분석법을 확립할 수 있습니다.

ICH와 FDA는 거대 분자 생체분석 연구를 표준화하는 데 도움이 되는 여러 지침 문서를 발행했습니다. 이러한 권장 사항은 해당 규제 기관의 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.

LC-MS-MS 기술은 생물학적 생물학적 분석에 더 적합하도록 발전했지만, 새로운 생물학적 제제를 만들고 측정해야 하는 비전문가에게는 다양한 질량 분석 기술 및 기법, 시료 준비 방법 및 시약이 부담스러울 수 있습니다.

장비 및 소프트웨어의 새로운 발전은 생체분석 테스트의 일관성과 효율성에 상당한 변화를 가져와 환자 안전에 중요한 영향을 미치면서 보다 정확하고 규정을 준수하는 결과를 제공할 것입니다.

참조

1. Suma Ramagiri, LC–MS–MS를 사용한 생물분석 동향. 칼럼, 칼럼-12-07-2015, 11권, 22호.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt & Philip Timmerman, 규제된 생물분석 환경에서 거대 분자의 LC–MS/MS – 어떤 허용 기준을 적용해야 합니까? 미래과학, 바이오분석 VOL. 5, 아니요. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193