Con molte nuove terapie approvate ogni anno, la domanda di prodotti biologici ha visto una crescita esponenziale nel mercato farmaceutico. Nel comunità bioanalitica, lo studio delle grandi molecole è oggi un argomento di discussione caldo.

L’importanza crescente di peptidi e proteine ​​come agenti terapeutici, combinata con le colossali opportunità offerte dalla nuova tecnologia basata sulla MS, ha aperto un nuovo mondo per gli scienziati bioanalitici.

I test di legame del ligando (LBA) come i test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o l'identificazione UV di singoli peptidi utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sono i metodi standard per la quantificazione dei farmaci biologici.

Tuttavia, questi metodi sono in genere costosi, richiedono molto tempo per essere sviluppati e hanno selettività e reattività crociata degli anticorpi limitate.

Ciò si traduce in una mancanza di specificità dell'interferenza e in livelli di fondo elevati che non sono appropriati per soddisfare le specifiche del industria biofarmaceutica per identificare diverse proteine ​​e peptidi con crescente sensibilità e riproducibilità.

La cromatografia liquida combinata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS-MS) è stata ampiamente utilizzata per la bioanalisi di piccole molecole nei laboratori farmaceutici sin dagli anni '1980.

Come le molecole più piccole, anche la LC-MS-MS comporta vantaggi per i prodotti biologici:

• Non è suscettibile alla reattività crociata dell'anticorpo poiché la LC-MS-MS prevede la valutazione diretta delle proprietà chimiche dell'analita.
• Fornisce un'eccellente selettività, essendo in grado di discernere e quantificare isoforme estremamente omologhe con precisione e accuratezza su un ampio intervallo dinamico lineare, anche a bassi livelli.
• Grazie alla sua elevata sensibilità e selettività analitica, oltre alla sua capacità di elevata produttività, la LC-MS/MS è stata considerata la tecnica principale per misurare le concentrazioni di antipsicotici di prima e seconda generazione nei pazienti schizofrenici.

La spettroscopia di massa ha guadagnato un crescente interesse per l'analisi di peptidi e proteine ​​rispetto all'LBA perché:

• L'LBA rileva le molecole in base all'affinità di legame e alla struttura conformazionale 3D, ma potrebbe non essere in grado di distinguere tra una proteina e i suoi metaboliti.
• A differenza dell’LBA, gli approcci basati sulla MS hanno il potenziale e sarebbero in grado di produrre dati più precisi sui livelli di peptidi/proteine ​​invariati in situazioni in cui il metabolismo ostacola dati LBA affidabili.
• Le tecniche MS solitamente offrono concentrazioni assolute di farmaci. Ciò può dipendere dalla forma di analisi per i metodi LBA e possono fornire concentrazioni assolute o libere di farmaci.

Tuttavia, basato su LC-MS-MS bioanalisi per farmaci a grandi molecole pone una serie di nuovi ostacoli, come difficoltà nell’elaborazione dei campioni e nelle misure di estrazione per la quantificazione di grandi molecole.

I motivi includono quanto segue:

• I peptidi e le proteine ​​di fondo nelle matrici biologiche competono con la molecola bioterapeutica di interesse, creando problemi di interferenza e incidendo sull'accuratezza.
• La mancanza di prove significative durante la quantificazione deriva dall'impossibilità di catturare liberamente i farmaci che possono circolare nel siero.

Recentemente sono stati compiuti molti progressi tecnologici LC-MS-MS che possono aiutare a risolvere tutte queste preoccupazioni.

In particolare, l'aumento dell'efficienza di ionizzazione e della trasmissione ionica nei recenti strumenti a triplo quadrupolo ha notevolmente migliorato la sensibilità, consentendo di rilevare i prodotti biologici a livelli di picogrammi o sub-femtogrammi.

I progressi nelle tecnologie all'interno del sistema LC-MS-MS includono una migliore focalizzazione delle collisioni ioniche, che porta più ioni al rilevatore, nonché aggiornamenti alla gamma dinamica del rilevatore per aumentare la sensibilità e l'efficienza della bioanalisi.

Recentemente, c'è stato un crescente interesse nell'integrazione dell'arricchimento dell'immunoaffinità dell'LBA con la quantificazione LC-MS-MS per integrare gli LBA con la sensibilità e la selettività delle tecnologie LC-MS-MS con maggiore precisione e capacità di cattura immunitaria più ampie.

LC-MS/MS con cambio di colonna automatizzato, sorbente impaccato per microestrazione (MEPS)/LC-MS/MS e estrazione con pipette monouso (DPX)/LC-MS/MS sono alcune delle tecniche recenti utilizzate per quantificare molecole di grandi dimensioni .

Due metodi principali sono ampiamente utilizzati quando si utilizzano tecnologie basate su LC-MS/MS per la bioanalisi di grandi molecole:

1. Approccio LC-MS(/MS) con analita intatto

Questo approccio viene utilizzato prevalentemente per peptidi, piccole proteine ​​e oligonucleotidi con un peso molecolare tipicamente inferiore a 4–8 kDa.

2. Approccio LC–MS/MS utilizzando una fase di digestione

Questo approccio è più complesso e viene utilizzato principalmente per proteine ​​o peptidi più grandi. Questo approccio prevede una fase di digestione (enzimatica) in aggiunta all'approccio con analita intatto, in cui la proteina/peptide viene digerita in peptidi più piccoli.

Oggi è più comune utilizzare i tradizionali strumenti LC-MS/MS a triplo quadrupolo per la quantificazione sia per l'approccio con analita intatto che digerito.

Secondo gli standard esistenti, 4-6-15 (quattro campioni QC su sei devono rientrare nel 15% del valore nominale) viene utilizzato come criterio di approvazione per i test LC-MS/MS molecolari di grandi dimensioni. I requisiti di approvazione 4-6-20 vengono proposti per analiti intatti più grandi, in particolare, se viene utilizzato un approccio ibrido LC-MS/MS.

Un peptide marcato per l'analisi peptidica oppure una proteina intatta marcata o un peptide marcato possono essere utilizzati come standard interno (IS) per stabilire un metodo LC-MS/MS di successo.

Numerosi documenti guida sono stati pubblicati dall'ICH e dalla FDA per aiutare a standardizzare gli studi di bioanalisi di grandi molecole. Queste raccomandazioni possono essere trovate sul sito web dell'agenzia di regolamentazione appropriata.

Sebbene le tecnologie LC-MS-MS siano progredite fino a diventare più appropriate per la bioanalisi biologica, per i non esperti che necessitano di creare e misurare nuovi prodotti biologici, la varietà di tecnologie e tecniche di spettrometria di massa, metodi di preparazione dei campioni e reagenti potrebbe essere travolgente.

I nuovi progressi nella strumentazione e nel software apporteranno cambiamenti sostanziali nella coerenza e nell’efficienza dei test di bioanalisi, fornendo risultati più accurati e conformi con significative conseguenze sulla sicurezza dei pazienti.

BIBLIOGRAFIA

1. Suma Ramagiri, Tendenze nella bioanalisi utilizzando LC-MS-MS. La Colonna, La Colonna-12-07-2015, Volume 11, Numero 22.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt e Philip Timmerman, LC–MS/MS di grandi molecole in un ambiente bioanalitico regolamentato: quali criteri di accettazione applicare? Scienza del futuro, BIOANALISI VOL. 5, n. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193