Con muchas terapias nuevas aprobadas anualmente, la demanda de productos biológicos ha experimentado un crecimiento exponencial en el mercado farmacéutico. En el comunidad bioanalítica, el estudio de moléculas grandes es ahora un tema candente de discusión.

La creciente importancia de los péptidos y proteínas como agentes terapéuticos, combinada con las colosales oportunidades que ofrece la nueva tecnología basada en la EM, ha abierto un nuevo mundo para los científicos bioanalíticos.

Los ensayos de unión de ligandos (LBA), como los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) o la identificación UV de péptidos individuales mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), son los métodos estándar para la cuantificación de fármacos biológicos.

Sin embargo, estos métodos suelen ser costosos, su desarrollo requiere mucho tiempo y tienen una selectividad y reactividad cruzada de anticuerpos limitadas.

Esto da como resultado una falta de especificidad de interferencia y altos niveles de fondo que no son apropiados para cumplir las especificaciones del industria biofarmacéutica para identificar diferentes proteínas y péptidos con una sensibilidad y reproducibilidad cada vez mayores.

La cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem (LC-MS-MS) se ha utilizado ampliamente para el bioanálisis de moléculas pequeñas en laboratorios farmacéuticos desde la década de 1980.

Al igual que las moléculas más pequeñas, la LC-MS-MS también conlleva ventajas para los productos biológicos:

• No es susceptible a la reactividad cruzada del anticuerpo porque LC-MS-MS implica una evaluación directa de las propiedades químicas del analito.
• Proporciona una selectividad excelente, pudiendo discernir y cuantificar isoformas extremadamente homólogas con precisión y exactitud en un amplio rango dinámico lineal, incluso a niveles bajos.
• Debido a su alta sensibilidad y selectividad analíticas, además de su capacidad de alto rendimiento, LC-MS/MS se ha considerado la técnica principal para medir las concentraciones de antipsicóticos de primera y segunda generación en pacientes con esquizofrenia.

La espectroscopia de masas ha ganado un mayor interés para el análisis de péptidos y proteínas que el LBA porque:

• LBA detecta moléculas basándose en la afinidad de unión y la estructura conformacional 3D, pero es posible que no puedan distinguir entre una proteína y sus metabolitos.
• A diferencia de LBA, los enfoques basados ​​en MS tienen el potencial y serían capaces de producir datos más precisos sobre los niveles de péptidos/proteínas sin cambios en situaciones donde el metabolismo obstaculiza los datos confiables de LBA.
• Las técnicas de EM suelen ofrecer concentraciones absolutas de medicamentos. Esto puede depender de la forma del ensayo para los métodos LBA, y pueden proporcionar una concentración absoluta o libre de fármacos.

Sin embargo, basado en LC-MS-MS Bioanálisis de fármacos de moléculas grandes. plantea una serie de nuevos obstáculos, como dificultades en el procesamiento de muestras y medidas de extracción para la cuantificación de moléculas grandes.

Las razones incluyen las siguientes:

• Los péptidos y proteínas de fondo en las matrices biológicas compiten con la molécula bioterapéutica de interés, creando problemas de interferencia y afectando la precisión.
• La falta de evidencia significativa durante la cuantificación surge por no poder captar fármacos libres que puedan circular en el suero.

Recientemente, se han realizado muchos avances tecnológicos LC-MS-MS que pueden ayudar a resolver todas estas preocupaciones.

En particular, el aumento de la eficiencia de ionización y la transmisión de iones en los instrumentos recientes de triple cuadrupolo ha mejorado enormemente la sensibilidad, lo que permite detectar productos biológicos a niveles de picogramos o subfemtogramos.

Los avances en las tecnologías dentro del LC-MS-MS incluyen un enfoque mejorado por colisión de iones, que trae más iones al detector, así como actualizaciones en el rango dinámico del detector para aumentar la sensibilidad y eficiencia del bioanálisis.

Recientemente, ha habido un interés creciente en integrar el enriquecimiento de inmunoafinidad de LBA con la cuantificación LC-MS-MS para integrar LBA con la sensibilidad y selectividad de las tecnologías LC-MS-MS con mayor precisión y capacidades de captura inmune más amplias.

LC-MS/MS con cambio de columna automatizado, sorbente empaquetado para microextracción (MEPS)/LC-MS/MS y extracción con pipeta desechable (DPX)/LC-MS/MS son algunas de las técnicas recientes que se han utilizado para cuantificar moléculas grandes. .

Se utilizan ampliamente dos métodos principales cuando se utilizan tecnologías basadas en LC-MS/MS para el bioanálisis de moléculas grandes:

1. Enfoque LC-MS(/MS) de analito intacto

Este enfoque se utiliza predominantemente para péptidos, proteínas pequeñas y oligonucleótidos con un peso molecular típicamente inferior a 4 a 8 kDa.

2. Enfoque LC-MS/MS utilizando un paso de digestión

Este enfoque es más complejo y se utiliza principalmente para proteínas o péptidos más grandes. Este enfoque implica un paso de digestión (enzimática) además del enfoque del analito intacto, donde la proteína/péptido se digiere en péptidos más pequeños.

Hoy en día, lo más común es utilizar instrumentos tradicionales de triple cuadrupolo LC-MS/MS para la cuantificación tanto del analito intacto como del digerido.

Según los estándares existentes, 4-6-15 (cuatro de seis muestras de control de calidad deben estar dentro del 15 % del valor nominal) se utiliza como criterio de aprobación para ensayos LC-MS/MS moleculares grandes. Se proponen requisitos de aprobación 4-6-20 para analitos intactos de mayor tamaño, en particular, si se utiliza un enfoque híbrido LC-MS/MS.

Se puede utilizar un péptido marcado para análisis de péptidos o una proteína intacta marcada o un péptido distintivo marcado como estándar interno (IS) para establecer un método LC-MS/MS exitoso.

La ICH y la FDA han publicado varios documentos de directrices para ayudar a estandarizar los estudios de bioanálisis de moléculas grandes. Estas recomendaciones se pueden encontrar en el sitio web de la agencia reguladora correspondiente.

Si bien las tecnologías LC-MS-MS han progresado hasta ser más apropiadas para el bioanálisis biológico, para los no expertos que necesitan crear y medir nuevos productos biológicos, la variedad de tecnologías y técnicas de espectrometría de masas, métodos de preparación de muestras y reactivos podría resultar abrumadora.

Los nuevos avances en instrumentación y software traerán cambios sustanciales en la consistencia y eficiencia de las pruebas de bioanálisis, proporcionando resultados más precisos y conformes con importantes consecuencias para la seguridad del paciente.

Referencias

1. Suma Ramagiri, Tendencias en bioanálisis mediante LC-MS-MS. La Columna, La Columna-12-07-2015, Volumen 11, Número 22.
2. Magnus Knutsson, Ronald Schmidt y Philip Timmerman, LC-MS/MS de moléculas grandes en un entorno bioanalítico regulado: ¿qué criterios de aceptación aplicar? Ciencia del futuro, BIOANÁLISIS VOL. 5, NO. 18, https://doi.org/10.4155/bio.13.193